具有区分力的甲磺酸地拉韦啶片体外溶出度方法研究
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中国药学杂志年6月第56卷第11期作者
方婷，王东凯，魏斌斌，孙婷中国医科大学药学院沈阳药科大学药学院摘要
目的建立并验证具有区分力的甲磺酸地拉韦啶片(mg)体外溶出方法，为仿制药的开发提供参考。方法建立了测定甲磺酸地拉韦啶片HPLC的体外溶出度方法，通过原料药的溶解性以及原研药品和自制制剂在pH1.2、pH4.5［4mg·mL－1十二烷基硫酸钠(SDS)］、pH6.0(4mg·mL－1SDS)和水(4mg·mL－1SDS)中的溶出行为，采用相似因子(f2)法评价溶出行为的相似性，筛选出具有区分力的溶出方法。结果自制制剂B与原研药品在4种介质中溶出行为相似(f2均大于50)，自制制剂A、C、D在4种介质中均存在f2小于50的情况。结论采用桨法50r·min－1在pH4.5(0.4%SDS)、pH6.0(0.4%SDS)和水(0.4%SDS)中测定本品溶出度具有一定区分力。关键词
甲磺酸地拉韦啶片;原研药品;自制制剂;溶出度;区分力;相似因子法_正文_甲磺酸地拉韦啶(商品名:RESCRIPTOR，规格:mg)于年4月经美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市，是非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)，用于治疗Ⅰ型获得性免疫缺陷综合征(acquiredimmunodeficiencydiseasesyndrome，AIDS)［1］，其对HIV-Ⅰ型感染者疗效好，但价格昂贵且国内没有仿制药。体外溶出是评价口服固体制剂内在质量的重要手段，而评估仿制药与原研制剂体外溶出行为相似的有效途径是具有区分力的溶出方法［3］。甲磺酸地拉韦啶为BCSⅡ类药物［2］，生物利用度(85±20)%，在水中几乎不溶。本实验研究了RESCRIPTOR具有区分力的溶出方法，为仿制药开发时的产品质量控制和一致性评价提供参考。1
仪器与试药
DP30A单冲压片机(北京国药龙立科技有限公司)，BYA小型包衣机(上海申江压力容器有限公司)，Shimadzu－10A高效液相色谱仪(LC－10ATvp泵、SPD－10A紫外检测器和SIL－10A自动进样器，Shimadzu公司)，KQ－DB型数据超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，BSS、BTD型精密电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，PB－10型酸度计(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，SHZ-A型恒温水浴振荡器(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)，RC－D溶出度试验仪(天津市天大天发科技有限公司)。RESCRIPTOR?(规格:mg，批号:V，辉瑞制药有限公司)，甲磺酸地拉韦啶自制制剂A、B、C、D(规格:mg，批号:、、、)，甲磺酸地拉韦啶原料药(批号:，沈阳沃森药物研究所)，甲磺酸地拉韦啶对照品(批号:，沈阳沃森药物研究所)。微晶纤维素(日本旭化成株式会社)，交联羧甲基纤维素钠、胶态二氧化硅、硬脂酸镁(安徽山河药用辅料股份有限公司)，喷雾干燥一水乳糖(ForemostFarmsUSACooperative)、OPADRYYS-1-EWHITE(上海卡乐康包衣技术有限公司)，虫白蜡(沧州东方蜂蜡胶业有限公司)，乙腈、甲醇、二水合磷酸二氢钠、冰乙酸为色谱纯，纯净水，磷酸二氢钠、枸橼酸、盐酸、氢氧化钠、无水醋酸钠、十二烷基硫酸钠为分析纯。2
方法与结果
2.1甲磺酸地拉韦啶片的制备2.1.1处方以甲磺酸地拉韦啶为主药，交联羧甲基纤维素钠为崩解剂，微晶纤维素(Microcrystallinecellulose，MCC)、喷雾干燥-水乳糖为稀释剂，胶态二氧化硅、硬脂酸镁为润滑剂，根据MCC与乳糖比例的不同设计了4种处方见表1，处方A、B、C、D的稀释剂比例分别为3∶1、2∶1、1∶1、1∶2。2.1.2制备工艺片芯的制备:将甲磺酸地拉韦啶原料药和其余辅料分别过目筛粉碎，备用。依次称取、混合处方量的甲磺酸地拉韦啶、微晶纤维素、喷雾干燥一水乳糖和交联羧甲基纤维素钠，以等量递加的方式依次加入胶态二氧化硅和硬脂酸镁，混合均匀，压片硬度11～13kg·cm－2。包衣工艺:将片芯筛去浮粉，放入已预热好的包衣锅中，包衣锅转速20～25r·min－1，片床温度35～45℃内，喷枪到片床的距离20～30cm，喷液速度3～5mL·min－1，喷雾压力0.5～0.7MPa，用包衣溶液包衣至片剂增重约3%，虫白蜡抛光5min左右，自然放置6～8h使之固化。2.2甲磺酸地拉韦啶原料药在不同pH介质中平衡溶解度的测定2.2.1色谱条件色谱柱:CosmosilC18(4.6mm×mm，5μm)，流动相:50mmol·L－1磷酸二氢钠缓冲液-乙腈(55∶45)，流速:1.0mL·min－1，检测波长:nm，柱温:40℃，进样量:10μL。2.2.2不同pH溶液和水中平衡溶解度的测定［4］采用经典摇床法，将过量甲磺酸地拉韦啶原料药置于mL锥形瓶中，分别加入50mL不同介质溶液［pH1.2盐酸溶液、pH3.8ABS(醋酸盐缓冲液)、pH4.5ABS、pH5.5PBS(磷酸盐缓冲液)、pH6.0PBS、pH6.8PBS］，超声溶解至溶液过饱和，放入37℃恒温水浴振荡器中振摇48h后取样，用0.45μm微孔滤膜快速过滤，取续滤液适当稀释作为供试品溶液，每个介质平行制备3份样品。用甲醇溶液配制每1mL含μg的对照品溶液。按“2.2.1”项下色谱条件进样，HPLC外标法计算。结果表明，甲磺酸地拉韦啶在pH1.2、3.8、4.5、5.5、6.0、6.8和水中的溶解度分别为.38、.25、0.82、0.44、73.20、.60、90.00μg·mL－1，随着pH值增加，溶解度先下降后略有上升，说明甲磺酸地拉韦啶是pH依赖型药物，在pH1.2中溶解度最大且仅在此条件下达到漏槽条件，在pH5.5溶解度最低。2.3具有区分力溶出方法的确定2.3.1溶出介质的选择FDA溶出方法数据库中RESCRIPTOR的溶出度测定方法:桨法;转速:50r·min－1;溶出介质:0.05mol·L－1PBS(pH6.0，含6mg·mL－1SDS);溶出体积:mL;取样时间:10，20，30，45，60min。参考上述方法选择pH6.0作为溶出介质;根据平衡溶解度实验结果，选择溶解度最高的pH1.2作为介质;地拉韦啶的解离常数pKa为4.6，并且pH4.5作为pH-溶解度曲线的拐点，因此选择pH4.5;因其是包衣制剂和难溶性药物，最后选择水为介质［5-6］。地拉韦啶在pH4.5、pH6.0、水中几乎不溶或溶解度低，参考FDA的溶出度测定方法，加入阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)增溶，而不同厂家SDS的纯度、性状有所不同，增溶效果也不同。药物溶出的速度、溶出度与SDS自身纯度、含有混合物比例及碳链的长短有关［7］。SDS用量应为0.01～10mg·mL－1，SDS加入过少，药物不能溶解，SDS加入过多，药物溶解过快导致溶出方法没有区分力。本实验通过考察SDS来源和SDS浓度对原研品溶出行为的影响来优化溶出方法。2.3.2SDS来源的考察选取中国食品药品检定研究院(NationalIntitutesforFoodandDrugControl，NIFDC)和3个国内厂家生产的SDS，生产信息见表2。以桨法50r·min－1测定原研药品在mL，pH6.0(4mg·mL－1SDS)中的溶出度，分别于5、10、15、20、30、45、60min取样10mL，同时快速补加同体积介质，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液注入高效液相色谱仪，按溶出度测定方法色谱条件检测，各点累积溶出度见表3。结果表明，不同厂家的SDS对原研药品溶出速率有很大影响，中检院和恒兴的SDS能促进原研药品在45min时累计溶出度达到90%，而其他2个厂家的SDS增溶效果不好，考虑研发阶段成本问题，选择恒兴生产的SDS用作溶出介质中的增溶剂。2.3.3SDS浓度的考察按FDA公布的溶出条件，分别对RESCRIPTOR(mg)、自制制剂(处方A、B、C、D)进行溶出度考察，结果见表4，表4结果表明，原研品、自制制剂D在15min时累计溶出度大于85%，其余3种处方制剂在15min释放大于80%，4个处方溶出度的相似因子均大于50，该溶出条件较宽松，不能很好区分不同处方的制剂，因此将通过减少SDS的加入量优化溶出条件。以桨法50r·min－1测定RESCRIPTOR(mg)在pH6.0中的溶出度，分别考察2，3，4，6mg·mL－1SDS对原研品溶出度的影响，分别于5、10、15、20、30、45、60、90、min取样10mL，同时快速补加同体积介质，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液注入HPLC，按“溶出度测定方法”色谱条件检测，绘制溶出曲线见图1。图1结果表明，加入6mg·mL－1SDS时，原研品在15min时累计溶出度大于85%，释放过快;加入2、3mg·mL－1SDS，在30min达到85%，但在min未完全释放，因此选择在pH6.0中加入4mg·mL－1SDS，在30min达到85%，且在min时能释放完全。同法测定原研品在pH4.5和水介质中加入不同浓度SDS时的溶出度。原研品在pH4.5和水介质中加入2、3mg·mL－1SDS时，在min均释放不完全，而加入4mg·mL－1SDS时，30min释放大于85%，曲线平滑，因此在这2个介质中也都加入4mg·mL－1SDS。按“2.2”项下方法测定地拉韦啶在pH4.5、pH6.0和水中加入不同浓度SDS时的平衡溶解度，结果见表5，表5结果表明，地拉韦啶在上述条件下测得的溶解度，均能满足漏槽条件。2.4溶出度测定方法的建立与验证2.4.1高效液相色谱条件色谱柱:CosmosilC18(4.6mm×mm，5μm)，流动相:50mmol·L－1磷酸二氢钠缓冲液-乙腈(45∶55)，流速:1.0mL·min－1，检测波长:nm，柱温:35℃，进样量:10μL。2.4.2溶液的制备对照品储备液:精密称取甲磺酸地拉韦啶对照品约27.5mg，于50mL量瓶中，加适量甲醇超声溶解并稀释成每1mL含μg的溶液。对照品溶液:精密移取对照品储备液2mL于10mL量瓶中，分别用pH1.2、pH4.5(4mg·mL－1SDS)、pH6.0(4mg·mL－1SDS)和水(4mg·mL－1SDS)溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。供试品溶液:取待测片剂，按溶出度测定方法，分别在规定的时间点取样10mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。空白溶液:取相应样品的不同pH值溶出介质作为空白溶液。2.4.3专属性实验按“2.4.2”项下方法配制对照品溶液，按甲磺酸地拉韦啶片的处方比例，分别用4种溶出介质配制空白辅料溶液，按“2.4.1”色谱条件进行分析，结果见图2，表明辅料不干扰甲磺酸地拉韦啶的测定。2.4.4滤膜吸附性实验精密称取甲磺酸地拉韦啶原料药约27.5mg，置于mL量瓶中，分别用不同溶出介质作为稀释液，加适量稀释液超声溶解，稀释至刻度，作为对照品溶液;在对照品溶液中按处方比例加入空白辅料，摇匀，分别过不同孔径的滤膜且弃去不同体积初滤液，取续滤液作为供试品溶液。按“2.4.1”项下色谱条件进行分析，结果见表6，0.22和0.45μm滤膜对甲磺酸地拉韦啶吸附率均小于2%，滤膜吸附作用均可忽略不计。使用0.45μm滤膜弃掉5mL初滤液时吸附率最小，故最终选择此方法配制溶液。2.4.5标准曲线制备按“2.4.2”项下方法配制对照品储备液，分别精密量取对照品储备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL置于不同25mL量瓶中，分别用pH1.2、pH4.5(4mg·mL－1SDS)、pH6.0(4mg·mL－1SDS)和水(4mg·mL－1SDS)溶液稀释至刻度，摇匀，作为线性系列浓度溶液。按“2.4.1”项下色谱条件进行分析，以峰面积(A)为纵坐标，进样浓度(ρ，μg·mL－1)为横坐标进行线性回归，绘制标准曲线，得回归方程分别为y=ρ+，r=0.(pH1.2);y=ρ+，r=0.(pH4.5);y=20ρ+，r=0.(pH6.0);y=ρ+，r=0.(水);结果表明，在上述溶液中，地拉韦啶在22.0～.0μg·mL－1内，浓度与峰面积之间线性关系良好。2.4.6加样回收率实验精密称取甲磺酸地拉韦啶原料药约5.5、13.5、27.5mg各3份于不同mL量瓶中，按甲磺酸地拉韦啶片处方比例加入空白辅料，溶出介质稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液;另精密称取甲磺酸地拉韦啶对照品适量，加适量溶出介质超声溶解，稀释制成每1mL含μg的溶液，作为对照品溶液。按“2.4.1”项下色谱条件进行分析，pH1.2、pH4.5、pH6.0、水中的平均回收率分别为99.2%(RSD=1.1%，n=9);99.4%(RSD=1.0%，n=9);99.8%(RSD=0.64%，n=9);99.1%(RSD=1.1%，n=9);结果表明，方法回收率好，能够准确测定样品浓度。2.4.7稳定性实验按“2.4.2”项下方法配制对照品储备液，精密移取对照品储备液2mL于10mL量瓶中，分别用溶出介质稀释至刻度，摇匀，作为稳定性供试品溶液。室温下放置，分别于0、2、4、6、8h精密量取供试品溶液10μL注入高效液相色谱仪进行分析，结果见表7，峰面积RSD值均小于2%，表明8h内主药在4种介质中均较稳定。2.4.8溶出度测定方法取本品，按《中国药典》年版溶出度与释放度测定法(通则第二法)，转速50r·min－1，温度37℃，在4种溶出介质中测定溶出度，依法操作，于5、10、15、20、30、45、60min时取溶液适量，0.45μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。另取甲磺酸地拉韦啶对照品适量，精密称定，配制成每1mL约含甲磺酸地拉韦啶μg的溶液，作为对照品溶液。按“2.4.1”项下色谱条件测定，外标法计算不同时间点片剂的溶出量，绘制溶出曲线。2.5稀释剂比例对溶出方法区分力的验证［4，8］按处方A、B、C、D分别制备MCC与乳糖比例为3∶1、2∶1、1∶1、1∶2的甲磺酸地拉韦啶片。并在4个溶出条件下测定原研品与自制制剂的溶出度，绘制溶出曲线见图3，采用非模型依赖法中的相似因子(f2)法计算自制制剂与原研品的相似因子［9］。结果见表8，片剂在pH1.2中5min溶出均大于85%，而在pH4.5(4mg·mL－1SDS)、pH6.0(4mg·mL－1SDS)、水(4mg·mL－1SDS)中的溶出行为均存在明显差异。由于MCC的疏水性和崩解性，乳糖的亲水性，稀释剂比例不同时［10］影响药物的溶出，MCC较多时，在pH4.5、6.0中释放较参比慢，在水中释放较快;MCC较少时刚好相反。本品在后3种介质中溶出度测定方法具有良好的区分力。自制制剂B与原研品在4种介质中相似因子均大于50，与原研品体外溶出行为相似。3
结论
按FDA公布的甲磺酸地拉韦啶片溶出度检测方法，原研品在该条件下15min溶出度已达85%，该方法不能真实反应产品的内在特性，缺乏区分力。本实验通过考察原料药的溶解性，原研药品在pH4.5、pH6.0和水溶液中加入SDS的浓度，确定了4种溶出介质。通过不同稀释剂比例的自制制剂验证了甲磺酸地拉韦啶片在pH4.5(4mg·mL－1SDS)、6.0(4mg·mL－1SDS)、水(4mg·mL－1SDS)中，桨法，50r·min－1，测定溶出度的方法具有区分力，建立了有效评价制剂的体外溶出度方法，为后续仿制药的开发提供了一定的参考。4
讨论
稀释剂(MCC与乳糖)比例不同的地拉韦啶片剂在pH4.5(4mg·mL－1SDS)、6.0(4mg·mL－1SDS)、水(4mg·mL－1SDS)介质中溶出速度的不同，这是由MCC和乳糖共同作用导致的。根据实验结果，含MCC较多的自制片在水中溶出较快而在pH4.5ABS、6.0PBS中较慢，可能是由于MCC在水介质中起到了主要作用，MCC具有疏水性，但其分子之间存在氢键，受压时氢键缔合，具有高度的可压型，当水分进入片剂内部，MCC分子之间的氢键断裂，片剂迅速崩解，加速了片剂的释放;而在pH4.5ABS、6.0PBS2个缓冲盐介质中或许是由于体系中离子数目的增加破坏了体系的氢键，这时由乳糖发挥主要作用，乳糖作为填充剂具有亲水性，当乳糖量较多时或能促进难溶性的地拉韦啶溶出。具体的作用机制有待进一步研究确证。参考文献
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